实验大比拼丨使用NanoBiT技术进行的蛋白质相互作用细胞内定位成像

蛋白质相互作用（PPI）是指两种蛋白质之间直接物理接触的反应过程。鉴于大多数细胞过程都涉及到多种蛋白质的共同作用，研究成对或更大群体的蛋白质相互作用在药物开发和疾病研究等多个研究领域都发挥着重要作用。在体外环境下，有多种方法可以检测蛋白质相互作用，但这些体外模型不能准确还原细胞内环境。此外，一些PPI在体检测方法需要裂解细胞并使用专门的设备才能进行定量检测。为了克服这些挑战，Promega开发了NanoLuc Binary Technology （NanoBiT）。NanoBiT是一种结构互补报告分子系统，可用于PPI的细胞内检测。它已成功应用于药物筛选、信号传导分析和病毒感染机制分析等一系列研究领域。该系统由一个LargeBiT（LgBiT；17.6 kDa）和一个Small BiT（SmBiT；11个氨基酸）两个亚基组成，可分别与待测蛋白融合。若两个待测蛋白存在相互作用，LgBiT 会和 SmBiT 结构互补形成功能性荧光素酶，从而与底物反应产生明亮的发光信号（图1）。

图1. NanoBiT蛋白质相互作用系统概览。图像承蒙Promega提供。
 

NanoBiT的细胞内定位成像

为进行细胞质和细胞核表达，我们将两种载体对转染到HeLa细胞中。第一对为非靶向FKBP-SmBiT对照载体和FRB-LgBiT对照载体。第二对为细胞核靶向NLS¹-FKBP-SmBiT对照载体和FRB-LgBiT对照载体（图2）。FKBP和FRB会在雷帕霉素刺激下结合产生发光信号。

图2. FKBP/FRB NanoBiT和NLS-FKBP/RRB NanoBiT的细胞内定位。

随后，我们使用IXplore Live for Luminescence显微成像系统对表达NanoBiT的HeLa细胞进行生物发光成像²。

为了定位细胞核，我们使用Hoechst33342对HeLa细胞进行了复染，并在同一显微镜上进行荧光成像（图3）。由于非靶向FKBP/FRB NanoBiT在整个细胞质中扩散，我们在整个HeLa细胞中都观察到了生物发光信号。

而NLS-FKBP/FRB NanoBiT的生物发光信号通过与Hoechst33342荧光信号重叠，被证实位于细胞核。

图 3. FKBP/FRB NanoBiT和NLS-FKBP/RRB NanoBiT的细胞内定位。

 

实验条件：

• 显微镜：IXplore Live for Luminescence显微镜系统²（图4）

• 相机：imagEM EM-CCD相机(Hamamatsu Photonics)

• 物镜：LUCPLFLN60XPH（图5）

• 成像透镜：0.35X

• EM增益：1200

• 呋喃嗪浓度：1/200稀释

• 雷帕霉素最终浓度：30 nM

• 曝光时间：相衬50 ms/生物发光3 min/荧光100 ms
  
  图4. IXplore Live for Luminescence显微镜系统
  

  图5. LUCPLFLN60XPH及UPLFLN40XPH物镜

  图6显示了雷帕霉素刺激前后的NLS-FKBP/FRB NanoBiT生物发光变化情况。雷帕霉素刺激后细胞核内的生物发光强度增加。这些结果表明，在雷帕霉素刺激下，FKBP和FRB在细胞核内结合，这种相互作用引起了NanoLuc的生物发光。显微成像使我们能够观察到活细胞内细胞溶质和细胞核生物发光强度变化，从而检测到雷帕霉素刺激引起的FKBP和FRB的相互作用。
  
   

  图 6. 雷帕霉素刺激引起的NLS-FKBP/FRB生物发光强度变化。
   

  实验条件：

  载体：NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit载体（各50 ng）

  显微镜：IXplore Live for Luminescence显微镜系统²

  相机：imagEM EM-CCD相机(Hamamatsu Photonics)

  EM增益：1200

  物镜：UPLFLN40XPH

  成像透镜：0.35X

  曝光时间：相衬50 ms/生物发光30 s/荧光100 ms

  延时间隔：40 s

   

   

   

   

  使用光度计和生物发光显微镜进行PPI探测

  NanoBiT和HiBiT3技术使我们能够使用光度计实现高通量PPI检测，而显微成像技术使我们能够将这些PPI的细胞内定位可视化。将光度计与生物发光显微镜联用检测PPI具有诸多优点。在观察局部发生的PPI或其细胞内定位变化时，我们可以先使用显微成像来确认其定位的准确性，然后再使用光度计进行高通量测量。该系统无需额外荧光成像便可确认细胞内定位。我们可以使用表达NanoBiT或HiBiT的同一构建细胞系来检查细胞内定位和高通量光度计探测。

  更多IXplore Live for Luminescence相关信息，请点击“阅读原文”查阅。

  致谢

  本应用说明的作者是Taro Hayashi，Evident生物工程、高级光学生物工程、研究与开发研究员。
   

  1.细胞核定位信号（我们使用了3倍重复细胞核定位信号）。

  2.基于IXplore Live显微镜的生物发光成像系统。该系统是根据日本大阪大学长井教授、Tokai Hit., Co, Ltd.及Evident联合开发的成果设计的。这项工作是在日本科学技术振兴机构开发先进测量和分析系统的计划下完成的。

  3.用于通过使用11个氨基酸肽标签(HiBiT)和大约18 kDa NanoLuc荧光素酶片段(LgBiT)的生物发光探测靶蛋白的HiBiT技术。

   

   

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