实验大比拼丨这条鱼几岁？全玻片扫描系统克服检查鱼耳石挑战

鲱鱼属鱼类（也称青鱼）在北大西洋海洋渔业史上发挥了关键作用，20世纪初，有关它们的研究对渔业科学的发展起到了至关重要的作用（图1）。这些油性鱼类作为重要食用鱼也有着悠久的历史。
鲱鱼经常在渔场和海岸附近的大型鱼群中洄游，特别常见于北太平洋和北大西洋（包括波罗的海）的温带浅水域以及南美洲西海岸附近。有三种鲱鱼已得到公认，约占渔业鲱鱼捕捞总量的90%。鱼龄和生长研究对于了解产卵、增长、栖息地利用、仔稚鱼持续时间以及种群年龄结构的时间和量级非常重要。而这些知识又对制定适当的渔业管理政策具有重要意义。通过计算耳石环可以确定鱼的年龄。
图2. 鲱鱼耳石。

鱼耳石在鱼的一生中都会附着多层碳酸钙和胶状基质。吸积率随鱼类的生长而变化，通常冬季生长较少，夏季生长较多，这导致出现类似树木年轮的环。通过计算环数，可以确定鱼的年龄（以年表示）。此外，在大多数鱼种中，碳酸钙和胶状基质的沉积在日常循环中交替进行，因此可以天为单位确定鱼的年龄。这些信息需要使用显微镜获得，可以为早期生命史研究提供重要数据。

实验过程

研究人员提取了耳石，将其嵌入丙烯酸树脂中，并将其研磨至约50 μm厚。

以往，使用配备有偏振光功能的手动直立显微镜来观察耳石并计算每日环数。

各层（环）的可见性随着焦点的不同而变化，这使得这种方法非常耗时，因为观察者必须不断地重新聚焦耳石。

奥林巴斯SLIDEVIEW VS200研究级全玻片扫描系统可用于自动化执行耳石图像捕获，从而节省大量时间（图3）。该系统可配置为使用偏振光或明场，以不同放大率采集具有多达41个平面的Z轴图像。在透射明场中，可以调整电动孔径光阑，通过关闭与物镜的数值孔径有关的孔径光阑来提高对比度。（图4A）

图3.  奥林巴斯SLIDEVIEW VS200研究级全玻片扫描系统

实验结果

图4A（左）. 使用VS200在40倍（0.95 NA）下采集的幼年鲱鱼耳石图像（包含18个平面的Z轴图像），孔径光阑开口为50%

图4B（右）.  使用偏振光在40倍（0.95 NA）下采集的成年鲱鱼耳石（包含30个平面的Z轴图像）

图像承蒙丹麦灵比国家水生资源研究所海洋生物资源部Bastian Huwer博士提供

幼鱼耳石的直径约为75 μm。成鱼耳石的直径约为1180 μm。图4B是使用偏振光显微技术拍摄的，该技术主要用于观察具备光学各向异性可见性质的样本。扫描系统必须在样本前的光路中配备一个偏光镜，在物镜后孔径和相机端口之间的光路中配备一个检偏镜（第二个偏光镜）。图像对比度来自平面偏振光与双折射（或双重折射）样本的相互作用，产生两个单独的波分量，每个波分量在相互垂直的平面上偏振。

集中观察耳石的中心时，耳石环的密度要比外部大得多。这种现象在图5A和5B中清晰可见。这些图像还显示了在多个Z平面（Z轴图像）中采集图像的重要性，因为环的可见性在不同的级别下会发生变化。

VS200系统让耳石图像采集自动化，将用户从繁琐的手动对焦和采集任务中解脱出来。由于图像是数字化的，因此可以开发全自动数字图像分析程序来计算耳石层数和测量年龄。


图4A（左）. 使用VS200在40倍（0.95 NA）下采集的幼年鲱鱼耳石图像（包含18个平面的Z轴图像），孔径光阑开口为50%

图4B（右）.  使用偏振光在40倍（0.95 NA）下采集的成年鲱鱼耳石（包含30个平面的Z轴图像）

图像承蒙丹麦灵比国家水生资源研究所海洋生物资源部Bastian Huwer博士提供

幼鱼耳石的直径约为75 μm。成鱼耳石的直径约为1180 μm。图4B是使用偏振光显微技术拍摄的，该技术主要用于观察具备光学各向异性可见性质的样本。扫描系统必须在样本前的光路中配备一个偏光镜，在物镜后孔径和相机端口之间的光路中配备一个检偏镜（第二个偏光镜）。图像对比度来自平面偏振光与双折射（或双重折射）样本的相互作用，产生两个单独的波分量，每个波分量在相互垂直的平面上偏振。

集中观察耳石的中心时，耳石环的密度要比外部大得多。这种现象在图5A和5B中清晰可见。这些图像还显示了在多个Z平面（Z轴图像）中采集图像的重要性，因为环的可见性在不同的级别下会发生变化。

VS200系统让耳石图像采集自动化，将用户从繁琐的手动对焦和采集任务中解脱出来。由于图像是数字化的，因此可以开发全自动数字图像分析程序来计算耳石层数和测量年龄。
 

此外，成鱼耳石标本相当厚（高达34 μm），并且不是很透明，因为它们是由碳酸钙组成的。VS200系统具有能够克服这些挑战并获得高质量图像的灵活功能。对于厚样品，系统可以使用偏振光在多个Z平面上扫描样品。为了提高耳石样品的对比度，可以利用电动调节的孔径光阑，改变通光量，增加样品对比度，使年龄环更清晰可见，系统可搭载AI深度学习算法，在图像识别采集和后期分析上提高工作效率，让计数统计等工作更简单准确。

致谢

本应用说明的制作由丹麦灵比国家水生资源研究所海洋生物资源部Bastian Huwer博士协作完成并提供。

2023年，我们开启了全新栏目【实验大比拼】，期望与您分享具有挑战、多元、新颖等的实验方法，为您提供帮助。

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